培養室（Lab） Labで受精卵はどうすごしていくの？

Labで受精卵はどうすごしていくの？

胚培養士のお仕事紹介

胚培養士は体外受精におけるすべての技術的操作を担っています。
ここでは胚培養士のお仕事と受精卵が培養室でどう過ごしていくのか詳しくご紹介します。

1．採卵
2．媒精
3．観察
4．凍結
5．融解
6．移植

1.採卵 ～採卵から検卵までの流れ～

採卵

採卵とは超音波モニターを用いて卵巣の位置を確認しながら卵胞を穿刺し、卵子が含まれる卵胞液を回収することです。医師が採卵を行い、胚培養士はその検卵を行います。
採卵により回収された卵胞液は、採卵室と培養室をつなぐPass boxを介して培養室内に運ばれ、顕微鏡を用いて卵胞液の中から卵子を見つけ出します。

この操作を検卵といい、回収した卵子は培養液で洗浄後、直ちに受精卵の培養に用いられるインキュベーターに保管されます。
この時に必ず、検卵者はdishに書かれた患者さまの名前を他の胚培養士と同時にダブルチェックし、卵子の取り違えを防止しています。

検卵終了後に、他の胚培養士がもう1度卵胞液に卵子の見逃しがないかダブルチェックを行います。
これを「再検」と言い、患者さまから採取された卵子を１つも見逃すことなく全て回収するために行っています。

このように当培養室内の業務では一人で進める項目は一つもなく、必ず2人以上そして2回以上の確認を行っています。

2.媒精 ～体外での受精操作について～

高度生殖医療(ART)では、本来であれば体内で行われる卵子と精子の受精を体外で行います。この受精操作には2種類の方法があります。 1つは、卵子の細胞質内に直接精子を注入することで受精させる顕微授精(ICSI)、 もう1つは卵子の周りに精子をふりかけて精子自らの力で受精させる体外受精(Conventional-IVF)です。

これらの方法により得られた正常な受精卵は体外で一定期間培養し、子宮内に移植されます。ARTにより誕生した赤ちゃんは日本で毎年約5.6万人(誕生する赤ちゃんの約16に1人の割合)の赤ちゃんが誕生しています(2018年日本産科婦人科学会より引用)。

顕微授精(ICSI)

卵子は120μm(約1mmの1/10)と顕微鏡で拡大しないと見えない大きさのため、ICSIには高度な技術や経験、設備が必要となります。運動精子が少なく精子の運動が弱い、また抗精子抗体陽性など受精障害のある患者さまは体外受精による受精が難しい場合があり、このような症例にはICSIが必要となります。
当院では、泌尿器科のドクターと連携し無精子症の患者さまへの治療として顕微鏡下精巣精子回収術(micro-TESE)や精巣上体精子回収術(MESA)で採取された精子を用いてのICSIも行っています。

①ガラス管で卵子を固定します。細いガラス針には1精子吸引します。
②精子を細いガラス針の先端に止めた状態に保ちます。
　この状態で針先を押し進めて卵子の細胞膜を破り、細胞質の中に精子を入れます。

ICSIのポイント！
ICSIは、たくさんの精子の中から受精に適した形態が良く運動性の高い精子を選択し受精操作に用います。
そして選んだ精子に不動化という処理を行います。精子不動化では精子の尾部を細いガラス管でこすりつけることによって精子の運動を止めます。この処理は、精子から卵子を活性化する因子を漏出させるきっかけとなります。
精子不動化を行った直後にICSIを行うと、精子から卵子細胞質内に卵子活性化因子が漏出し、受精へと繋がります。そのためICSIにおいて精子不動化は重要なステップとなります。

体外受精(Conventional-IVF)

体外受精とは、採取された卵子を体外受精用の培養液に移し、卵子の周りに濃度を調整した精子を加えて受精させる方法です。
利点は、精子自らの力で卵子の透明帯を通過して受精するため体内での受精環境に近いことです。 しかし、欠点として運動精子数が少ない場合や、精子の運動が弱い場合、また原因不明の受精障害のある患者さまは体外受精による受精が難しい場合があり、時には全く受精卵が得られない場合もあります。

そのため当院では初回の治療でも体外受精と顕微授精を併用することを基本としています。また前回の治療で、体外受精の受精率が良くなかった場合や採取された卵子数が少ないときには受精操作はICSIを優先しています。

3.観察 ～受精卵の成長～

体外受精により得られた受精卵は1日～7日間、体外で培養を行います。 胚移植・凍結に向けて複数個の受精卵を体外で培養するとき、最も状態の良い受精卵を選択するために培養期間中には観察が必要となります。当院の観察は受精操作翌日を1日目として1・3・5・6・7日目に、受精卵の成長段階に合わせて的確な評価を行います。 培養1日目～3日目の受精卵の状態とその評価方法について紹介します。

受精操作を行った翌日(培養1日目)に受精の確認を行います。
正常な受精卵には精子由来の雄性前核と、卵子由来の雌性前核の2つの前核が見えます。(左写真) この2つの前核は、受精後22時間程度で融合して1つとなり消えてしまいます。そのため、観察は朝の8時に必ず行います。 全胚凍結の患者さまは、この状態で凍結を行います。前核が3個以上みられる受精卵は多前核といい、当院では染色体異常の可能性があるため原則として移植や凍結の対象とはなりません。

受精後、1つの細胞であった受精卵は細胞分裂(1細胞→2細胞→4細胞→8細胞・・・)を繰り返していきます。
左の写真は4細胞期胚の写真です。


培養3日目では、発育が順調に進むと細胞数が8個の8細胞期胚(左写真)に到達します。培養3日目の受精卵は、細胞数(7~9細胞が良好)・細胞同士大きさ(均一なほど良好)・フラグメント(少ないほど良好)を総合的に評価します。フラグメントとは、受精卵が細胞分裂をする際に発生する細胞断片です。
3日目で移植を予定している場合は、この基準に従って最も状態のよい受精卵を移植に用います。

分割期胚の評価

培養3日目は、細胞分裂が進んで6～9個の細胞を持つ受精卵となります。
このような形態の受精卵を分割期胚と呼びます。

細胞数・細胞同士の大きさ・フラグメントの程度を総合的に評価し、A～Eの5段階で評価

桑実胚の評価

成長の進んだ培養3日目以降の受精卵は、細胞同士が密集して接着（compaction）し始め桑実胚と呼ばれる形態となります。

接着の程度により、ComA,ComB,ComCの3段階で評価

実際の評価

培養3日目では、当院の過去の解析結果を元にして作られた上記基準に従って移植する受精卵を選択します。
しかし、現状として形態（見た目）だけの評価は確実ではなく、形態評価が妊娠率や流産率に与える影響を正確に予測することはできません。そのため、評価に関わらず全ての受精卵は妊娠する可能性を持っています。
私たち胚培養士は、患者さまからお預かりした受精卵が最も良い状態で確実に移植できるように成績の良い培養液や インキュベーターを選択し、培養環境の改善を続けていきたいと考えています。

胚盤胞への発育
培養3日目の受精卵は細胞分裂を続けると、やがて細胞同士が密着し結合を始めます。 さらに成長を続けると細胞質内部に隙間ができて胞胚腔を形成し初期胚盤胞となります。 培養5日目胞胚腔は受精卵全体に広がり、将来、胎児となる内部細胞塊(ICM)と胎盤になる栄養外胚葉(TE)の識別が可能な胚盤胞になります。
胞胚腔が拡張すると胚盤胞を包む透明帯は薄くなり拡張胚盤胞となります。
さらに胚盤胞の発育が進むと、薄くなった透明帯が破れて胚盤胞は透明帯の外に脱出します。 これを孵化(hatching)といい、孵化の途中の胚盤胞を孵化中胚盤胞、孵化した後の胚盤胞を孵化後胚盤胞といいます。

胚盤胞まで成長した胚が凍結の対象となります。


胚盤胞の評価
胚盤胞は胞胚腔の広がりと孵化の程度から評価を行います。

・初期胚盤胞
・胚盤胞
・拡張胚盤胞　
・孵化中胚盤胞
・孵化後胚盤胞

内部細胞塊(ICM)と栄養外胚葉(TE)はそれぞれA～Cの3段階の評価を行います。

4.凍結 ～受精卵・精子の凍結保存について～

なぜ受精卵を凍結するのか？ 

1度の採卵で胚移植数回分の受精卵を凍結することができれば採卵による負担を軽減することができます。

採卵した周期の子宮環境が移植に適さないときには妊娠する可能性が低いため、受精卵を凍結します。そうすることで次周期に子宮環境を整えた状態で移植を行うことができます。

採卵した周期に移植を行うと卵巣過剰刺激症候群(OHSS)を発症する可能性があります。しかし、受精卵を凍結し次周期に移植することでOHSSを回避することができます。

移植に用いなかった余剰胚を培養してできた胚盤胞は、凍結することで胚移植の機会を増やすことができます。

受精卵の凍結方法について

受精卵の大部分（約60%）は水分でできており、そのまま凍結すると細胞内で水分が結晶化し体積が大きくなることで細胞に亀裂が生じ壊れてしまいます。凍結保存の技術によってこのような障害が起こらないようにしています。
当院で行われている凍結方法はガラス化法という方法です。ガラス化法では、受精卵の水分を凍結保護剤と入れ替え、常温から一気に液体窒素の中(－196℃)に浸し凍結を行うため、細胞内で水分が結晶化することなく凍結を行うことができます。
現在、当院で凍結した受精卵を融解した際の生存率は99.4%となっています(2019年)。 

手技の様子

凍結の容器について

「Top」とは受精卵凍結専用の容器であり、先端にある幅0.8mmのプラスチック状の板に受精卵を載せることができます。Top本体には1本1本バーコードを貼って区別しており、融解時に間違えることがないように管理しています。
Topを収納するための専用の容器を「ケーン」と呼び、1本のケーンで10本のTopを入れることができます。

凍結保存について

受精卵や精子の凍結は、私たち胚培養士が空調が管理されセキュリティの整った培養室内で行います。そのため患者さまには、受精卵や精子の凍結を間近で見ていただくことはできません。しかし患者さまに受精卵や精子がどのように凍結保存されているかを知っていただくことで、少しでも安心して治療に臨んでいただけるのではないかと考え、ここでは受精卵や精子の凍結に用いる器材について簡単に説明させていただきます。
また、下記では凍結検体更新手続き時の注意点についてご案内します。

精子の凍結

精子の凍結は凍結から精子を守る凍結保護剤と呼ばれる液と混ぜられ、専用のストローに詰めて液体窒素で凍結を行います。

5.融解 ～融解胚移植について～

受精卵の融解

受精卵の凍結に使用する容器を「Top」といいます。Top先端のプラスチックフィラメントに受精卵を載せ、液体窒素につけることで凍結保存を行います。融解時にはTop先端を素早く融解液①に入れ、融解します。

受精卵の約60%は水分が占めています。凍結時には、水分が氷の結晶となり細胞質は傷害を受けます。
そのため受精卵凍結時には、細胞質の水分を除いて凍結保護剤と入れ替えています。
融解時には細胞質に水分を戻さなければならないため、融解液②・③・④と徐々に濃度を変えていき、凍結時に使用した凍結保護剤を浸透圧を利用して除去します。

融解後は、37℃に加温した状態で、専用の培養液中で移植まで培養を続けます。

3日目移植と胚盤胞移植について

当院では受精直後の前核期胚での凍結、または培養して成長した胚盤胞の状態で凍結を行っております。
前核期胚を融解した場合、体外で3日間培養を行い分割期胚に成長した受精卵を移植します。胚盤胞を融解した場合は融解した当日の午後に移植を行います。
受精卵を融解し、患者さまの子宮に戻るまでしっかりと管理させていただきます。

凍結融解胚移植とは?

凍結融解胚移植とは、体外受精や顕微授精で得られた受精卵を凍結保存し、採卵した周期とは別の周期に融解して子宮の中に移植する方法です。これに対して、採卵した周期に得られた受精卵を培養し凍結せずに移植する方法を新鮮胚移植といいます。新鮮胚移植では受精卵を凍結する必要はありませんが、採卵のために行う卵巣刺激の影響で子宮内膜が薄くなり子宮が移植に適さない環境となることがあります。

各年齢における新鮮胚移植と凍結融解胚移植の妊娠率の比較

当院では2013年よりすべての症例で凍結融解胚移植を行っています。その理由として、新鮮胚移植よりも凍結融解胚移植の方が高い妊娠率を期待できる事があげられます。凍結融解胚移植は、移植に適した子宮環境に整えた状態で移植を行うことができるというメリットがあり、新鮮胚移植よりも高い妊娠率を得ることができると考えられます。
当院では、年齢ごとの新鮮胚移植と凍結融解胚移植の妊娠率を調査したところ、各年齢群ともに凍結融解胚移植の妊娠率が新鮮胚移植と比較して10％前後上昇していることが確認されています。
海外でも凍結融解胚移植を選択する割合も増えています1),2),3)。今後凍結融解胚移植がスタンダードになることが考えられます。

1)　Z Li, A Y Wang, M Bowman, K Hammarberg, C Farquhar,L Johnson, N Safi, and E A Sullivan A fresh(er) perspective on frozen embryo transfers Hum Reprod Open. 2019; 2019(2): hoz004.
2)　Nigel Pereira, M.D,Zev Rosenwaks, M.D. Cumulative live birth rates following a 'freeze-all' strategy: a population-based study Inklings Volume 106, ISSUE 2, P257-258, August 01, 2016
3)　2013 Assisted Reproductive Technology National Summary Report Figures

6.移植

孵化補助(Assisted hatching:AH)

そもそも孵化とは？

受精卵が胚盤胞に成長してから着床するまでに以下のような変化があります。

①受精卵は透明帯という殻の中で胚盤胞へと成長する。
②胚盤胞は成長と共に透明帯を押し広げ、やがて透明帯に亀裂が生じる。
③胚盤胞は透明帯の亀裂を押し広げていく。
④胚盤胞は透明帯の外へ出て、子宮内膜に着床する。
⇒胚盤胞が透明帯の外に出ていく一連の流れ（②～④）を「孵化」と呼びます。

Assisted hatching ：AHとは

AH は透明帯にレーザーを照射することで孔を開けるレーザー法や先端の鋭利なガラス管で透明帯に直接切り込みを入れて孔を開ける透明帯切開法、酸性溶液を透明帯に吹きかけ透明帯を溶かす酸性タイロード法などの方法があります。

その中で当院ではレーザー法を採用しています。レーザー法を採用している理由は、非常に安全性が高く、更に他の孵化補助の方法と比べて簡易的かつ迅速にAHを行うことができるためです。
レーザーは透明帯だけに照射するため内側にある細胞質に悪影響を与えることはありません。
AHは開孔と菲薄化（ひはくか）を症例によって使い分けているため、それぞれの違いについてご紹介します。

胚盤胞の孵化と妊娠・流産率について

通常、胚盤胞は孵化を経て着床します。しかし症例によっては透明帯が通常より厚いことや 硬い場合があります。そのような場合、胚盤胞は透明帯を破れず孵化できなくなる可能性があります。そのため当院では、基本的に全ての移植する胚にAHを行い、孵化へのサポートを行います。

移植

受精卵（胚）は患者さんの子宮内膜調整がされるまで凍結保存され、胚移植に合わせて融解を行っています。

例えば、分割期胚を移植(Day3移植orDay2移植)する場合は、前核期胚を融解し、インキュベーター内で数日培養を行って分割期胚に成長した受精卵を移植しています。
また、胚盤胞移植の場合は胚移植当日に融解を行っています。

培養室はOPE室の隣に位置しており、移植胚をOPE室へと移動させるPass boxという通り道があります。 Pass boxを通すことで素早く・安全に胚をOPE室へと運ぶことができます。

（写真の矢印で示された場所がPass boxです。Pass box越しにOPE室が見えています）

移植の流れ

患者さんがOPE室に入室され準備が整ったところで、移植胚が培養室から医師へと渡され、子宮内へと戻されます。
培養室では以下の内容が移植時に行われています。

① 胚を移植用の培養液に移し替える
② 胚を培養液と共にカテーテル(細くて柔らかい管)に詰める
　詰めたカテーテルごとPass boxを通しOPE室に運ばれます
③ カテーテルを患者様の子宮へ挿入する
④ 患者様の子宮に胚を戻す
⑤ 最後に確認する

という流れになっています。

左の写真の胚培養士が持っている白い管がカテーテルです。
先ほどお伝えしたPass boxを通して、すぐにOPE室に移植する胚が届くようになっています。

この流れにある最後の確認は、カテーテル内に胚が残っていないかを確認しています。
最後はカテーテルの中に培養液を数回出し入れし、胚が本当にカテーテル内に無いかを確認します。
最後の確認でカテーテルに無いということは、しっかりと患者様の子宮に戻ったという確認になります。

また、移植にはEmbryo Glue®(エンブリオ　グルー)という培養液を使用しています。
受精胚の接着剤というネーミングですが、ヒアルロン酸が豊富に入った粘度が高い培養液です。
このヒアルロン酸などが着床の手助けをしてくれるのですが、他の培養液に比べるとかなり高価な培養液になります。

病院によっては、オプション扱いや、院内規則に沿って限られた症例のみに扱われる培養液ですが、当院では少しでも早く患者様に結果をお届けするために、追加料金など頂かず、全症例一律、この培養液を使用しております。

培養液に関しても、当院は多くの検討を積んで、より良い結果で患者様に治療を提供したいと考えております。